Tento text je aktuálnějsí, než text na hlavní stránce, který jsem v poslední době neměl čas přepracovávat či aktualizovat.

 

V rámci tohoto plánu nabízíme disertační, diplomové případně bakalářské práce.

 

 

Rámcová představa zaměření vlastního výzkumu pro následujících 6 let (2015+).

 

Základní cíl výzkumu. Základním cílem výzkumu je pochopení struktury, dynamiky, funkce a evoluce molekul nukleových kyselin (DNA a RNA) pomocí nejmodernějších počítačových metod.

Zdůvodnění výzkumu a výchozí bod laboratoře. Molekuly nukleových kyselin jsou vzhledem ke své důležitosti zkoumány všemi dostupnými experimentálními metodami. Svět nukleových kyselin je však natolik komplikovaný, že dostupné experimentální metody zdaleka nedokáží postihnout všechny jeho klíčové aspekty. To otevírá prostor pro počítačové a teoretické metody, které dokáží alespoň některé z těchto mezer zaplnit a doplnit tak experimentální data a jejich interpretaci. Význam teoretických metod v oblasti studia nukleových kyselin stoupá, což souvisí výrazně i s trvalým nárůstem výkonnosti počítačů a vývojem nových výpočetních metod. Celkový význam výpočetní chemie lze dokumentovat i tím, že tento obor dostal v uplynulých 15 letech dvakrát Nobelovu cenu za chemii (1998 – základy výpočetní kvantové chemie a 2013 – multiscale modelling).

Moje laboratoř je v oboru výpočetní chemie nukleových kyselin dlouhodobě etablována a je považována za jednu z nejlepších světových laboratoří. V současnosti disponujeme rozsáhlým spektrem výpočetních metod. Hlavní důraz je kladen na počítačové simulace biomolekul s explicitním zahrnutím solventu a s použitím klasické potenciálové funkce a na kvantově-chemické metody. V obou oblastech došlo v posledních třech letech k dramatickým kvalitativním změnám. V oblasti počítačových simulací je to použití GPU (grafické karty) jednotek, které přineslo skokové zrychlení simulací o více než jeden řád. V oblasti kvantové chemie byly vyvinuty nové metody, které umožňují přesné výpočty na systémech o velikosti několika set atomů. Laboratoři se podařilo oba trendy zachytit, v čemž velkou úlohu sehrálo i rozumné využití prostředků z evropských fondů, pomocí nichž bylo možné zakoupit příslušný hardware a najmout zahraniční postdoky. Tyto faktory se již odrážejí na nárůstu publikační aktivity v letech 2013-2014. V oblasti kvantově-chemických výpočtů laboratoř dokonce publikovala první práci, v níž byl kvantově-chemicky popsán kompletní funkční fragment DNA o velikosti 8 nukleotidů. Kromě výše uvedených technik používáme v menší míře strukturní bioinformatiku a dále hybridní kvantově-klasické přístupy. Ačkoliv moje laboratoř provádí pouze teoretický výzkum, tento výzkum je poměrně úzce propojen s experimentem díky řadě spoluprací s experimentálními laboratořemi.

Plánovaný výzkum na nejbližší léta. V nejbližších letech se hodlám se svými spolupracovníky koncentrovat na následujících pět vzájemně propojených témat a jedno téma, které je více oddělené.

1) Studium strukturní dynamiky funkčních molekul RNA.

2) Studium katalytickým molekul RNA.

3) Studium komplexů mezi proteiny a RNA.

4) Studium DNA, zejména guaninových kvadruplexů.

5) Studium základních molekulových interakcí v nukleových kyselinách a modulárních bloků nukleových kyselin pomocí kvantové chemie.

6) Studium prebiotické chemie vedoucí ke vzniku života.

Prvním dvěma tématům se věnujeme od r. 2000 a 2004. Hlavní výhodou počítačových simulací je jejich schopnost přímo zobrazit stochastickou dynamiku RNA, která není dobře vizualizovatelná metodami rentgenostrukturní analýzy a kryoelektronové mikroskopie, jež zobrazují jen statické struktury zprůměrované v čase a přes velké množství částic. NMR metodika pro molekuly RNA má jen velmi omezenou aplikovatelnost z důvodu řídkosti experimentálně měřitelných charakteristik. Dynamika a flexibilita molekul RNA (Obr. 1) je klíčová pro pochopení jejich funkce, neboť všechny molekulární stroje jako třeba ribosom jsou stroje stochastické, které energii ke svému pohybu získávají přímo z tepelných fluktuací a k usměrnění pohybu využívají uvolňování chemické energie (ireverzibilní chemické kroky). V případě katalytických molekul RNA studujeme rovněž jejich reakční mechanismy na elektronové (kvantově-chemické) úrovni popisu (Obr. 2, Obr. 3).

V předchozích letech jsme studovali řadu systémů, jmenovitě tři flexibilní RNA segmenty z ribosomu, tři katalytické molekuly RNA a několik rekurentních (evolucí často užívaných) RNA modulárních bloků. Ve studiu řady z nich plánujeme pokrčovat. Cílem je získat konkrétní informace o strukturní dynamice jednotlivých systémů, vlivu mutací (srovnáním chovaní simulací mutovaných struktur s bioinformatickými daty, s evolucí sekvencí příslušných molekul RNA a s jejich konzervací). V případě ribozymů chceme rovněž přispět k odhalení jejich reakčních mechanismů. Specifická data získaná pro různorodé systémy navíc umožní zobecnit náš pohled na obecné principy strukturní dynamiky RNA. U nejmenších systémů (RNA hairpin loops) se chceme pokusit během nejbližších let nasimulovat přímo jejich folding z nestrukturovaného stavu do nativní konformace (Obr 4). Folding RNA je z hlediska experimentu mnohem hůře studovatelný než struktura. U některých dalších systémů (např. dekódovací místo ribosomu na helixu 44 a iniciační dimerizační místo retrovirů jako je HIV) budeme rovněž studovat jejich interakci s ligandy (antibiotiky a virostatiky) a doufáme, že tyto výpočty přispějí k lepšímu pochopení principů interakcí RNA s ligandy.

Třetí téma znamená zásadní strategické rozšíření dosavadního výzkumu ze studia izolovaných molekul RNA na její komplexy s proteiny. Biochemické zdůvodnění je následující. V buňce se RNA téměř vždy nachází v komplexech s proteiny (ribonucleoprotein, RNP). To, že se doposud teoreticky studovaly téměř výhradně izolované molekuly RNA je dáno obtížností studia RNP systémů, které, kromě jiného, vyžadují mnohem rozsáhlejší simulace a tedy i silnější počítače. V současné době již toto téma rozbíháme. Ačkoliv zatím není žádný članek publikovaný, několik studií máme ve vysokém stupni rozpracovanosti. Prvním postupovým cílem je určit metodické postupy, jak RNP komplexy studovat a jaké jsou limitace modelování. Dostupná literatura se k tomu použít nedá, protože, jak uvedeno výše, celosvětové zkušenosti se simulacemi RNP komplexů jsou velmi fragmentované a omezené. Proto v současné době studujeme více než 10 různých RNP systémů (Obr. 5) a vytváříme tak metodickou referenční studii pro tento typ biomolekulárních komplexů. V posledních týdnech se zdá, že jsme schopni navrhnout metodické postupy, které umožní dostatečně stabilní a věrohodné simulace RNP komplexů a tudíž realizace tohoto tématu se zdá plně dosažitelná. Předběžné výsledky předčily naše očekávání. Kromě obecné studie RNP komplexů se hodláme zaměřit na jednu třídu těchto komplexů, tzv. RNA binding domény (RRM), kde chceme jít ve výzkumu maximálně do hloubky biochemické problematiky. Před několika týdny jsme navázali spolupráci (a podáváme HFSP grant) s laboratoří F.H.T. Allaina v Zurichu, což je světový lídr v oblasti strukturní biologie a NMR RRM komplexů a v současné době již probíhá intenzívní společný teoreticko-experimentální výzkum. Studium RNP komplexů bude zřejmě klíčových tématem našeho výzkumu. Téma je úzce propojené s prvními dvěma tématy.

Čtvrté téma obsahuje především studium kvadruplexů, jimiž se zabývám již 15 let a v podstatě mám v této oblasti postavení nejlepší teoretické laboratoře na světě. Nicméně, studium kvadruplexů se stalo v posledních letech žhavým tématem. Z molekuly, která před 15 lety zajímala omezený okruh laboratoří a byla přitažlivá zejména pro své unikátní fyzikálně-chemické vlastnosti, se stala nejdůležitější nekanonická forma DNA a důležitá forma RNA. Dramaticky vzrostl i počet výpočetních laboratoří, jež se kvadruplexy zabývají, takže nám narostla i konkurence. DNA kvadruplexy hrají pravděpodobně řadu biologických úloh, včetně podílu na vzniku rakoviny (telomerní sekvence, onkogeny), jednoznačně je již prokázána úloha kvadruplexů tvořených na messenger RNA při regulaci syntézy bílkovin, kvadruplexy jsou potenciální farmakologický terč a jeví se jako nosná architektura pro supramolekulární systémy a molekulární stroje na bázi DNA. Naším cílem bude využití výpočetních metod ke studiu topologické variability kvadruplexů (Obr. 6), studium jejich foldingu, konformační variability jejich jednořetězcových smyček spojujících jednotlivé řetězce vlastního kvadruplexu a interakcí s ligandy. Kvadruplexy představují ideální systém rovněž pro vývoj a testování metod, což propojuje téma čtyři s tématem pět. RNA kvadruplexy pak propojují téma čtyři s tématy jedna až tři.

Páté téma představuje druhé strategické rozšíření výzkumu. Moderní kvantová chemie byla doposud využívána ke studiu malých systému, jako jsou páry bází, do velikosti 30-50 atomů. Ačkoliv tyto studie poskytly řadu naprosto unikátních fyzikálně-chemických informací, jejich přímá biochemická relevance je nižší. Díky novým technikám můžeme nyní kvantově-chemicky studovat segmenty o velikosti 250-1000+ atomů. První takovou práci jsme nedávnou publikovali (Obr. 7), jako první na světě, a další je v tisku. Strategickým cílem našeho výzkumu bude v nejbližších pěti letech etablovat kvantovou chemii velkých systémů jako nový nástroj molekulového modelovaní nukleových kyselin a naučit se tuto techniku správně synergicky užívat spolu s počítačovými simulacemi, bioinformatikou a experimentálními daty.

Šesté téma, prebiotické reakce, je relativně více specializované než výše uvedená témata, ale je intelektuálně i mediálně velmi zajímavé. V oblasti jsme začali pracovat v roce 2008 a v současnosti se již téma podařilo stabilizovat, definovat naši pozici v mezinárodním kontextu a nalézt experimentální partnery. Náš výzkum se zabývá vznikem základních komponent RNA, a to od úrovně syntézy bází nukleových kyselin až po problematiku ligace/polymerizace prvních molekul RNA. Budeme prověřovat možné scénáře těchto reakcí a teoretické predikce následně ověřovat experimentálně ve spolupracích. Příkladem jsou studie chemických reakcí vzniklých při dopadech meteoritů (experimentálně simulovaného pomocí laserových pulsů) a návrh mechanismu ribozomální aktivity RNA vedoucí k polymerizaci RNA z cyklických nukleosid-monofosfátů (experimenty zahrnují řadu biochemický technik). U všech experimentů hrají výpočetní metodiky klíčovou úlohu pro interpretaci experimentů a náměty na jejich další směřování.

Shrnutí. Základní výzkumné cíle na následujících 6 let budou logicky navazovat na úspěšný předchozí výzkum s řadou významných rozšíření, včetně dvou strategických. Cílem je i) získat nové a cenné informace o řadě konkrétních biochemicky relevantních systémů, ii) na základě studia řady systémů provést zobecnění výsledků a přispět tak k pochopení nejzákladnějších principů, jimž se řídí strukturní dynamika, funkce a evoluce nukleových kyselin a iii) přispět k vývoji metodiky počítačové chemie nukleových kyselin. K bodu ii) je možné podotknout, že ačkoliv výpočetní a teoretické techniky nemohou nahradit experimenty, jejich výhodou je analytický náhled na studované systémy a možnost srovnávání různých systémů a jejich modifikací. To umožňuje syntézu znalostí a lepší interpretaci experimentů. K bodu iii) lze podotknout, že ačkoliv vývoj metod není naším hlavním cílem, naše schopnost poměrně výrazně přispívat i k vývoji metodiky (což lze prokázat řadou předchozích prací) vyplývá přímo z toho, že získáváme unikátní empirické zkušenosti při studiu širokého spektra systémů. To nám dává velmi dobrou možnost testování různých metod a jejich následných úprav (například empirické potenciálové funkce pro počítačově simulace, kvantově-chemické metody pro studium velkých systému a metodiky zrychleného prozkoumávání konformačního prostoru biomolekul).

 

Květen 2014                                                                     Jiří Šponer

 

Obr. 1. Anisotropní flexibilita RNA K-turnu, rekurentního RNA motivu, který mj. může zprostředkovávat jako anizotropní molekulární kloub některé funkční pohyby v ribosomu (výsledek našeho již publikovaného výzkumu).

 

Obrázek 2. Selfcleavage RNA páteře, reakce katalyzovaná ribozymy.

 

Obrázek 3. Ukázka možného reakční mechanismu ribozymu (Hepatitis Delta Virus ribozyme) za účasti divalentního hořčíku predikovaná na základě pokročilého hybridního QM/MM výpočtu (práce v přípravě).

figure5

Obrázek 4. Předběžná studie publikovaná v roce 2013, kdy jsme pomocí speciální simulační metodiky poprvé dosáhli správného foldování atomistického modelu krátké molekuly RNA z nestrukturovaného stavu do nativního stavu, byť zatím výpočty nedovolují dostat plně konvergovaný průběh volné energie. Tyto studie hodláme v nejbližších letech zásadně rozšířit.

                                 

http://pubs.acs.org/appl/literatum/publisher/achs/journals/content/jctcce/0/jctcce.ahead-of-print/ct301086z/aop/images/large/ct-2012-01086z_0007.jpeg

 

Obrázek 5. Struktury několika vybraných RNP systémů, které nyní studujeme. Systém vlevo dole je jedna z RRM domén, systém dole uprostřed ukazuje RNA kvadruplex interagující s proteinem.

celkovy_prehled


 

Obrázek 6. Šest experimentálně známých topologií kvadruplexu DNA z lidské telomerní sekvence, (TTAGGG)n. Modré a fialové čtverce značí syn a anti orientace mezi guaninovými bázemi a cukry. Jedním z našich cílů je odhalit pravidla, jimiž se řídí termodynamická rovnováha těchto různých konformací téže sekvence, jakož i simulovat folding pathway.

 

Obrázek 7. První plně kvantově-chemicky optimalizovaná strukture krátkého DNA kvadruplexu (zelená) a srovnání s X-ray strukturou (červená). Jde o první funkční blok nukleových kyselin optimalizovaný plně kvantově-chemicky (publikováno v létě 2013). Tyto výpočty nám mj. umožnily dosáhnout plné shody mezi teorií a experimentem u kvalitativní předpovědi relativní stability různých topologických variant kvadruplexů a opravit tak náš předchozí teoretický model založený na použití klasické potenciálové funkce. Takovéto kvantově-chemické výpočty budou jedním z našich hlavních želízek v ohni v nejbližších pěti letech výzkumu.